據(jù)統(tǒng)計,至“十二五”期末我國濕污泥量將突破4600萬t,而污泥厭氧消化技術(shù)以其低能耗、高產(chǎn)出的經(jīng)濟優(yōu)勢成為污泥資源化利用的主要技術(shù)之一.除厭氧消化產(chǎn)甲烷以外,污泥產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸(fatty acids)也是實現(xiàn)污泥資源化的有效途徑,近年來,越來越多的學(xué)者開始關(guān)注污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸.目前,有關(guān)污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的研究主要集中在通過改進裝置構(gòu)型、產(chǎn)酸微生物生態(tài)、優(yōu)化控制運行條件,如控溫、pH等條件因素來提高產(chǎn)酸效率.已有研究表明,通過調(diào)節(jié)發(fā)酵污泥底物的C/N比可增加發(fā)酵產(chǎn)酸量并調(diào)控其產(chǎn)酸類型,然而,目前研究人員對污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中不同C/N比與關(guān)鍵酶酶活及有機酸產(chǎn)酸量間的關(guān)系并不清楚.僅有為數(shù)不多的研究,如優(yōu)化C/N比條件作為酒精發(fā)酵的實驗?zāi)Ｐ脱芯?而對于數(shù)學(xué)模型則沒有報道.數(shù)學(xué)模型法作為現(xiàn)代科學(xué)研究的重要手段,它有助于描述和理解生物處理系統(tǒng)的反應(yīng)過程,可為工程設(shè)計提供理論上的指導(dǎo);還有助于工藝的優(yōu)化和控制,從而更好地指導(dǎo)實際生產(chǎn)運行.
多元線性回歸是一種理想的描述多個因素(factor)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)方法,能較好地確定被解釋變量和解釋變量之間的關(guān)系,在很多領(lǐng)域得到了應(yīng)用.因此,本研究通過設(shè)置不同C/N比條件來調(diào)控污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸,在Matlab7.0平臺上建立多元線性回歸函數(shù)模型,擬合C/N比、關(guān)鍵酶酶活和產(chǎn)酸類型之間的關(guān)系,以期為今后污泥發(fā)酵產(chǎn)酸條件調(diào)控研究和工程(Engineering)放大提供參考.
2 材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 污泥與種泥
原始污泥取自無錫市太湖新城污水處理廠,發(fā)酵底物是經(jīng)過熱堿預(yù)處理的污泥上清液.污泥采集后置于陰涼處,風(fēng)干10 d,采用機械打碎儀粉碎,再過30目篩,密封置于-15 ℃冰柜中保存.
接種污泥來源于無錫某檸檬酸廠上流式厭氧污泥反應(yīng)器中的厭氧顆粒污泥.在100 ℃下煮沸2 h以殺死產(chǎn)甲烷菌,然后導(dǎo)入有效容積為2 L的UASB中進行馴化,活化種泥中的產(chǎn)酸菌,馴化溫度為35 ℃.每日監(jiān)測馴化種泥的pH值,待種泥馴化后出水pH值降低至4.0左右,穩(wěn)定3~5 d后,認為種泥馴化成功.原始（Original)污泥和污泥預(yù)處理(chǔ lǐ)液及接種種泥的性質(zhì)見表 1.
表 1 原始污泥、污泥預(yù)處理(chǔ lǐ)液和接種污泥的性質(zhì)
2.1.2 厭氧發(fā)酵
調(diào)節(jié)熱-堿預(yù)處理后離心液pH為10.0,取500 mL離心液置于1000 mL的厭氧反應(yīng)瓶中,分別加入不同量葡萄糖,以使得底物混合液的初始C/N比為12、56、69、156.接入馴化后的種泥,種泥接種量為10%.污泥發(fā)酵前充氮氣10 min以去除氧氣,然后迅速密封置于轉(zhuǎn)速為120 r?min-1和溫度℃的搖床厭氧發(fā)酵.在發(fā)酵期間,每12 h調(diào)節(jié)pH為初始的10.0.每24 h取樣1次,用針管吸出部分發(fā)酵液,取樣完成后調(diào)節(jié)pH并充氮氣保持厭氧.
2.1.3 實驗藥品和材料
本實驗采用的藥品包括4-甲基戊酸、磷酸(化學(xué)式： H3PO4)溶液、NaO
H、HCL等;主要儀器包括pH計、氣相色譜儀、馬弗爐、凱氏定氮儀,離心機等.
2.2 試驗方法 2.2.1 污泥初始指標測定
污泥預(yù)處理前后的總固體、溶解性固體及污泥揮發(fā)性固體的測定采用重量法,具體操作詳見GB11901-89和《水和廢水監(jiān)測分析方法》.pH值測定參照國標法.
污泥中的總脂類物質(zhì)采用Bligh-Dyer方法提取后,在 80 ℃下干燥直至溶劑完全揮發(fā)后,采用重量法測定.總氮采用凱氏定氮法測定.總蛋白含量通過凱氏氮減去氨氮后再乘以 6.25計算得到.氨氮采用納氏試劑比色法測定,污泥中的總碳水化合物采用甲醛離心法提取后,再用苯酚-硫酸法測定.用 Liquid TOC 分析(Analyse)儀測定總有機碳,詳見《水質(zhì)總有機碳的測定燃燒氧化-非分散紅外吸收法》.污泥中的總磷(P)含量用鉬酸銨分光光度法測定,詳見《水質(zhì)總磷的測定鉬酸銨分光光度法》.
2.2.2 關(guān)鍵酶活測定
乙酸激酶的活性采用文獻的方法提取并測定.磷酸轉(zhuǎn)移乙酰酶的提取方法同乙酸激酶,活性測定參照文獻方法.丁酸激酶微生物細胞的破壁方法和提取方法同乙酸激酶,活性測定采用文獻方法.磷酸轉(zhuǎn)移丁酰酶微生物細胞的破壁和提取方法同乙酸激酶,活性測定采用文獻方法. 甲基丙二酰CoA變位酶活性測定采用文獻方法.
2.2.3 揮發(fā)性短鏈脂肪酸的測定
采用GC法檢測揮發(fā)性短鏈脂肪(fat)酸的質(zhì)量濃度,樣品處理及色譜條件等參見文獻.為方便不同條件下產(chǎn)酸效率的比較,將測得的VFAs濃度折算成 COD值,換算方法參見文獻.
3 結(jié)果與討論
3.1 有機酸濃度的變化
分別設(shè)定底物初始C/N比值為12、56、156,進行厭氧發(fā)酵.發(fā)酵過程中時,體系中有機酸的產(chǎn)量分別如圖 1所示.由圖 1可以看出,底物初始C/N比不同,厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的末端酸化產(chǎn)物也不同.C/N比為12時,產(chǎn)量最大的為乙酸,在第5 d達到9.45 kg?m-3;其次是丙酸,第5 d時可以達到3.55 kg?m-3;最低是丁酸,第5 d時產(chǎn)量約為2.35 kg?m-3.當C/N比為56時,產(chǎn)量最大的為丙酸,在第5 d可達到10.36 kg?m-3;其次是乙酸,可以達到7.79 kg?m-3;最低是丁酸,產(chǎn)量約為2.79 kg?m-3.當C/N比為156時,產(chǎn)量最大的為丁酸,在第5 d達到13.59 kg?m-3;其次是乙酸,可以達到5.89 kg?m-3;最低是丁酸,產(chǎn)量約為4.72 kg?m-3.
圖 1 C/N比對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響
圖 2 底物發(fā)酵產(chǎn)酸的代謝途徑
3.2 多項式關(guān)系的數(shù)學(xué)模型的建立
在發(fā)酵過程中,通過設(shè)定不同C/N比條件,測定不同C/N比下關(guān)鍵（解釋:比喻事物的重要組成部分)酶的酶活和產(chǎn)酸量,則三者可以建立函數(shù)關(guān)系.短鏈脂肪酸的生成途徑如圖 2所示,乙酸生成的關(guān)鍵酶分別為乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)移乙酰酶,丁酸合成的關(guān)鍵酶有丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)移丁酰酶;丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸過程中,關(guān)鍵酶為甲基丙二酰CoA變位酶.由于底物C/N比的改變會導(dǎo)致產(chǎn)酸微生物體內(nèi)的酶活性改變,從而改變微生物不同代謝途徑的代謝通量,并最終導(dǎo)致各種短鏈脂肪酸的生成受到影響,由此產(chǎn)生了不同的產(chǎn)酸類型.因此,C/N比是自變量,而關(guān)鍵酶活性和產(chǎn)酸類型是因變量.
根據(jù)以上理論分析,為了建立C/N比、關(guān)鍵酶活、不同酸產(chǎn)量之間的函數(shù)關(guān)系模型,采用多元非線性回歸的方法,建立了二元二次多項式模型、二元三次多項式模型、二元三次多項式模型.
式中,Z為因變量,表示有機酸產(chǎn)量,X和Y為自變量,分別表示C/N比和關(guān)鍵酶活性,bi表示函數(shù)中的常數(shù).根據(jù)實測數(shù)據(jù)對以上3種多項式模型進行擬合優(yōu)度的檢驗,結(jié)果如表 2所示.
表 2 模型擬合優(yōu)度分析
表 2中,
A、
B、C分別表示3種關(guān)系式模型,乙酸-A
K、乙酸-PTA等分別表示各種產(chǎn)物酸與其對應(yīng)的關(guān)鍵酶.根據(jù)優(yōu)度擬合理論,R2大于 0.9的較好,因此,在多項式A乙酸-A
K、B乙酸-AK和C乙酸-AK的R2檢驗中,C乙酸-AK效果最好,為0.9327.同樣的,C乙酸-PT
A、C丙酸-MC
M、C丁酸-B
K、C丁酸-PTB的R2分別為0.9348、0.9494、0.9880和0.9771,均具有最高的R2.模型擬合優(yōu)度檢驗同時要求模型殘差平方和越小越好,因此,在多項式A乙酸-A
K、B乙酸-AK和C乙酸-AK的殘差平方和檢驗中,C乙酸-AK的效果最好,為0.0292.同樣的,C乙酸-PT
A、C丙酸-MC
M、C丁酸-B
K、C丁酸-PTB的殘差平方和分別為0.0076、1.8556、0.0038和3.1362,均具有最小的殘差平方和.綜合以上分析,可以判定二元三次多項式C模型擬合度最好.依據(jù)二元三次多項式C標準結(jié)構(gòu),結(jié)合實驗測得的不同C/N比條件下的關(guān)鍵酶活和各種有機酸產(chǎn)量,建立了可視化的三者之間的曲面模型.
3.3 C/N比-關(guān)鍵酶-乙酸曲面模型的建立
根據(jù)上述多項式C的形式,利用Matlab軟件進行擬合,得到多項式當中相應(yīng)bi的值,進而得出C/N比-關(guān)鍵（解釋:比喻事物的重要組成部分)酶AK-乙酸之間的定量關(guān)系表達式和C/N比-關(guān)鍵酶PTA-乙酸之間的定量關(guān)系表達式.
根據(jù)定量關(guān)系式和繪制得到圖 3的可視化曲面模型.從圖 3的曲面模型可以看出：在初始C/N比為10~50時,酶活性較低,乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶平均酶活性分別為1.06 U?mg-1和0.67 U?mg-1,而乙酸濃度從2.8 kg?m-3上升到7.8 kg?m-3.在初始C/N比為50~150時,AK和PTA酶活性較高,平均值分別為2.79 U?mg-1和1.08 U?mg-1,而乙酸濃度為2.6 kg?m-3.從以上數(shù)據(jù)可知,酶活性水平和乙酸產(chǎn)量不一致,說明在此C/N比條件下,乙酸主要不是通過丙酮酸途徑合成,而可能是通過丙酸、丁酸的轉(zhuǎn)化形成.其他學(xué)者的研究都表明,C/N比通過直接或間接影響產(chǎn)能過程及NADH/NAD+的氧(Oxygen)化還原偶聯(lián)過程,促使不同發(fā)酵產(chǎn)酸類型的形成.在低C/N比條件下,乙酸的產(chǎn)生主要是通過氨基酸之間的Stickland反應(yīng)形成,本文的曲面模型很好地解釋了這一結(jié)論.
圖 3 C/N比、產(chǎn)乙酸關(guān)鍵（解釋:比喻事物的重要組成部分)酶和不同酸產(chǎn)量之間的曲面模型所示.由C/N比-關(guān)鍵酶MCM-丙酸曲面模型可以看出,當 C/N比為 55~70時,甲基丙二酰CoA變位酶活性都有大幅度增加,同時丙酸的產(chǎn)量也開始上升,這與任南琪等的研究一致,表明丙酸型發(fā)酵中,丙酸產(chǎn)生于糖酵解（glycolysis）丙酮酸途徑.根據(jù)已有的理論研究,通常情況(Condition)下,丙酸型發(fā)酵代謝途徑有利于NADH+H+的氧化,而丁酸型發(fā)酵缺乏對 NADH 的再生能力.所以當 C/N 值處于56~69時,微生物的細胞合成速率較小,丙酸型發(fā)酵比丁酸型發(fā)酵有更高的穩(wěn)定性,產(chǎn)酸結(jié)果就形成丙酸型發(fā)酵,這也解釋了本文曲面模型當中丙酮酸的產(chǎn)量和關(guān)鍵酶活性大幅提升的原因.
3.5 C/N比-關(guān)鍵酶BK-丁酸曲面關(guān)系的數(shù)學(xué)模型的建立
C/N比-關(guān)鍵酶BK-丁酸之間的定量關(guān)系如式所示,C/N比-關(guān)鍵酶PTB-丁酸之間的定量關(guān)系如式所示.
在初始C/N比為150及更高時,丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)移丁酰酶的活性均有大幅度增加.以前的研究（research)表明,丁酸的產(chǎn)生主要由糖酵解丙酮（tóng）酸形成.隨著C/N值升高到156,碳作為微生物細胞的重要組成元素,促使了細胞合成代謝速率的提高,有機質(zhì)分解代謝過程中產(chǎn)生的部分NADH可以被厭氧微生物迅速地用于細胞合成而得以再生,所以,呈現(xiàn)較穩(wěn)定的丁酸型發(fā)酵類型.
已有研究表明,通過調(diào)控污泥預(yù)處理液的初始 C/N 值可實現(xiàn)乙酸、丙酸和丁酸不同厭氧發(fā)酵類型之間的轉(zhuǎn)變.在初始C/N比為10~50時,此時發(fā)酵是乙酸型發(fā)酵.而當 C/N 值為 55~70時,此時厭氧發(fā)酵類型則轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝?在初始C/N比為150及更高時,此時,丙酸型發(fā)酵類型則轉(zhuǎn)變?yōu)槎∷嵝?本文圖 3~5建立的曲面模型結(jié)果表明,所建立的模型能很好地反映這一趨勢,說明模型能較好地模擬C/N比調(diào)控下的污泥發(fā)酵產(chǎn)酸實驗結(jié)果.具體參見污水寶商城資料或
圖 4 C/N比、丙酸關(guān)鍵酶-甲基丙二酰CoA變位酶和不同酸產(chǎn)量之間的曲面模型
圖 5 C/N比、丁酸關(guān)鍵酶活和不同酸產(chǎn)量之間的曲面模型采用多元非線性回歸的方法建立了不同C/N比、關(guān)鍵酶活和酸產(chǎn)量之間的函數(shù)關(guān)系模型.經(jīng)擬合優(yōu)度、顯著性和殘差平方和等指標的比較,發(fā)現(xiàn)二元三次多項式模型的擬合優(yōu)度系數(shù)和顯著性高、殘差平方和較小,表明該模型能較好地擬合三因素之間的定量關(guān)系.
2)調(diào)節(jié)污泥水解液的C/N比分別為12、56、156,將測定的關(guān)鍵酶酶活和乙酸、丙酸、丁酸的結(jié)果代入建立的多項式模型,應(yīng)用Matlab 7.0 軟件得到了相應(yīng)的定量關(guān)系式和可視化的曲面模型,曲面模型的結(jié)果很好地驗證了不同C/N比條件下的產(chǎn)酸代謝途徑.
